在免疫學、疫苗研發、腫瘤免疫治療和傳染病研究領域，精準評估T細胞或B細胞的功能性免疫應答至關重要。ELISPOT（酶聯免疫斑點試驗，Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay）作為一種高靈敏度、單細胞水平的細胞因子或抗體分泌檢測技術，被譽為“免疫反應的顯微鏡”，能夠直觀、定量地揭示特定抗原刺激下免疫細胞的活化狀態，已成為現代免疫監測的核心工具之一。
一、工作原理
ELISPOT的基本原理類似于Western Blot與細胞培養的結合，其核心在于捕獲并可視化單個活化免疫細胞分泌的目標分子（如IFN-γ、IL-2、IL-4、Granzyme B或IgG）。具體步驟如下：
1.包被：將特異性捕獲抗體（如抗IFN-γ抗體）固定在PVDF膜底的96孔板上；
2.細胞孵育：加入外周血單個核細胞（PBMCs）或純化的T/B細胞，并加入抗原、肽段或多克隆刺激物；
3.分泌與捕獲：活化的細胞在數小時至數十小時內分泌細胞因子，隨即被周圍包被抗體原位捕獲；
4.檢測：移除細胞后，加入生物素標記的檢測抗體，再通過酶標親和素（如HRP-Streptavidin）催化底物（如BCIP/NBT）顯色；
5.結果讀取：每個分泌細胞在膜上形成一個清晰的紫色或藍色斑點（“spot”），斑點數量即代表抗原特異性效應細胞的頻率。
整個過程在單細胞分辨率下完成，靈敏度可達每10萬~100萬個細胞中檢測到1個陽性細胞，遠高于流式細胞術或ELISA。
二、性能特點
1.超高靈敏度
能檢測極低頻率的抗原特異性T細胞（0.01%~0.001%），特別適用于弱免疫應答或稀有細胞群研究。
2.功能導向，反映細胞活性
不僅識別細胞表型，更直接反映其功能性分泌能力，是評估免疫應答“質”與“量”的金標準之一。
3.單細胞分辨率
每個斑點對應一個活化細胞，可進行頻率統計與比較，數據直觀、可重復性強。
4.多因子檢測能力
通過熒光標記（FluoroSpot）技術，可在同一孔中同時檢測兩種或多種細胞因子（如IFN-γ/IL-2雙色），分析細胞多功能性（polyfunctionality）。
5.樣本需求量少
通常僅需10?~10?個PBMCs，適合臨床有限樣本（如兒童、腫瘤患者）的研究。
三、主要應用領域
1.疫苗研發與評價
在新冠、HIV、結核、瘧疾等疫苗臨床前及臨床試驗中，ELISPOT用于評估候選疫苗誘導的T細胞免疫應答強度與廣度，是FDA和EMA推薦的關鍵免疫原性指標。
2.腫瘤免疫治療監測
在CAR-T、TCR-T、PD-1/PD-L1抑制劑等療法中，通過檢測腫瘤抗原特異性T細胞的斑點形成情況，動態評估治療效果與免疫重建狀態。
3.自身免疫與過敏研究
分析Th1/Th2/Th17等亞群分泌譜，揭示疾病機制；例如，在1型糖尿病中檢測胰島抗原反應性T細胞。
4.傳染病免疫學
用于結核潛伏感染診斷（如T-SPOT.TB檢測）、EBV、CMV、HPV等病毒特異性T細胞應答評估。
5.移植免疫監控
監測受者對供體抗原的免疫反應，預測排斥風險或耐受狀態。
ELISPOT分析以其獨特的單細胞功能檢測能力，在精準免疫學研究中占據不可替代的地位。隨著自動化斑點計數儀、標準化試劑盒和多色FluoroSpot平臺的普及，其操作便捷性和數據可比性不斷提升。未來，在個體化醫療、伴隨診斷和免疫療效預測等領域，ELISPOT將繼續作為連接基礎免疫機制與臨床轉化應用的重要橋梁，為人類健康提供強有力的科學支撐。
更新時間：2026-02-10
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